Презентация "Технология рекомбинантных ДНК" 11 класс

• Лекция 1.
• Технология
• рекомбинантных
• ДНК.

• Клонирование ДНК – выделение гена

• Клон – бактерия, несущая данный ген

• Что нужно для выделения гена?
• • ДНК - источник гена
• • вектор и подходящий хозяин
• • средства расщепления ДНК –
• рестриктазы
• • инструмент для объединения
• фрагментов – ДНК-лигаза
• • способ введения векторной ДНК
• в хозяина
• • способ идентификации клонов

• E. coli

• Рестриктазы – специфические эндонуклеазы
• (более 900 ферментов изолировано из 230 штаммов бактерий)

• «липкие» концы,
• 5’-overhang

• «липкие» концы,
• 3’-overhang

• «тупые» концы

• (5’-конец длиннее)

• (3’-конец длиннее)

• Сайты расщепления двуспиральной ДНК
• тремя разными рестриктазами второго типа:

• невозможно пометить

• Защита бактериального генома; метилирование; клонирование

• Электрофорез ДНК: 1. разделение молекул по размеру

• подвижность молекул ДНК зависит
• от плотности агарозного геля

• концентрация агарозы

• В геле присутствует бромистый этидий,
• который интеркалирует в ДНК; комплекс
• флюоресцирует при 590 нм.

• Бромистый этидий (3,8-Диамино-
• 5-этил-6-фенилфенантридиум бромид, EtBr, Ethidium bromide)- интеркалирующий агент

• Бромид этидия интеркалирует в ДНК, уменьшая спирализацию ~ на 26°, разворачивает двойную спираль

• молекулы плазмидной ДНК
• разделяется при электрофорезе на три зоны

• С помощью электрофореза можно контролировать ход рестрикции плазмидной ДНК

• при наличии уникальных сайтов
• рестрикции для двух рестриктаз:

• линейная форма плазмиды

• фрагменты плазмиды

• результат обработки
• первой рестриктазой

• ход гидролиза
• второй рестриктазой

• однонитевой разрыв
• в случайном месте-
• релаксированная форма

• двунитевой разрыв
• в случайном месте–
• линейная форма

• Электрофорез ДНК:
• 2. разделение по форме молекул

• Лигирование ДНК – образование эфирной связи
• между конечными нуклеотидами

• «вставка», содержащая ген

• исходная
• кольцевая
• плазмида

• обработка двумя рестриктазами

• линейная ДНК с сайтами
• рестрикции на концах

• +

• + лигаза + АТФ

• векторная ДНК, содержащая ген

• он

• но

• р

• р

• он

• он

• но

• но

• р

• р

• он

• но

• он

• он

• но

• но

• фосфатаза

• + вставка ДНК

• Если концы плазмиды одинаковы, для повышения эффективности
• их лишают возможности объединиться без включения клонируемого гена

• «липкие» концы плазмиды

• эфирная связь между концами
• плазмиды уже не может
• образоваться

• лигирование возможно
• только при участии
• вставки

• ДНК-лигаза

• такая плазмида полностью
• замкнется в кольцо уже в бактерии

• р

• E. coli

• трансформация бактерий:
• тепловой шок или электропорация

• посев на агар с антибиотиком

• Отбор бактерий, несущих нужный вектор

• выделение плазмидной ДНК
• из отдельных колоний

• проверка рестрикцией и определением
• последовательности нуклеотидов

Отбор бактерий: ферментная система (бело-голубая селекция)

• MCS плазмиды находится внутри последовательности lacZ’, кодирующей N-концевой пептид β-галактозидазы, но не мешает образованию фермента после объединения с С-концевым пептидом. Растут голубые колонии. Однако клонирование в MCS нарушает рамку считывания N-концевого пептида, β-галактозидаза не образуется, растут белые колонии.
• Индукцию lac-оперона осуществляют с помощью ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), аналога аллолактозы, метаболита лактозы.

• X-gal
• 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-
• галактопиранозид

• β- галактозидаза

• галактоза

• 5-бромо-4-хлоро-
• гидроксииндол

• окисление

• 5,5’-дибромо-4,4’-дихлоро-индиго - нерастворимое соединение голубого цвета

Отбор бактерий- позитивная селекция

• Рестриктаза Eco47I вызывает гибель хозяйских клеток всех штаммов E.coli, которые не защищены метилированием, распознаваемым рестриктазой. Инактивация гена еco47IR в следствии инсерции – это основа механизма получения позитивной селекции, используя плазмиду pJET1.2. Для удобства работы сайт MCS, также как и промотор полимеразы Т7, используемые для позитивной селекции, помещены внутрь гена еco47IR.

• Векторная ДНК:

• автономная репликация в бактериях или дрожжах
• устойчивость к антибиотику
• удобные сайты рестрикции (MCS)

• Размер вставки, которую могут переносить:
• - плазмиды - до 10 тыс. пар оснований (п.о.)
• - вирусы (фаги) - до 25 тыс. п.о.
• - космиды - в среднем 45 тыс. п.о.
• - бактериальные искусственные хромосомы – до 300 тыс.п.о.
• - дрожжевые искусственные хромосомы - до 1 млн. п.о.

• Получение геномной библиотеки

• ген 1

• ген 2

• ген 3

• рестриктазы

• встраивание в разрезанный вектор

• ген 3

• смесь
• клонов

• трансформация
• бактерий

• ген 1

• ген 2

• Экспрессионная кДНК библиотека

• ген 1

• ген 2

• ген 3

• суммарная
• мРНК

• РНК/ДНК
• гибрид

• геномная
• ДНК

• обратная транскрипция

• двуспиральная
• кДНК

• деградация РНК

• синтез второй цепи ДНК

• транскрипция
• сплайсинг – удаление интронов

• выделение мРНК на
• олиго-dT носителе

• кДНК (cDNA) – комплементарная ДНК

• В ядре

• In vitro

• кДНК с «тупыми»

• концами

• присоединение «липких»
• концов

• лигирование в
• разрезанный вектор

• ген 3

• смесь
• клонов

• кДНК с «липкими»

• концами

• трансформация
• бактерий

• ген 1

• ген 2

• - не все равно из каких клеток и в каком состоянии выделена мРНК, поэтому важно подобрать выгодный
• источник и контролировать условия
• представительство данного гена зависит от уровня его экспрессии
• все молекулы в библиотеке кодируют белки
• выделенная ДНК будет содержать непрерывную кодирующую последовательность – открытую рамку
• считывания

• Сравнение геномной и экспрессионной библиотек:

• все равно из какой ткани выделена ДНК
• представительство данного гена зависит от числа его копий в геноме
• только малая часть генома млекопитающих кодирует белки (1,5% генома человека)
• интроны сильно увеличивают размер вставок: ни бактерии, ни дрожжи не смогут осуществить сплайсинг

• Дрожжевая дигибридная система –
• средство поиска белков-партнеров

• Транскрипционный фактор

• ДНК-связывающий
• домен

• Активационный
• домен

• ген-репортер

• ДНК

• участок
• связывания

• транскрипция

• белок-репортер

• Метод основан на использовании одного из транскрипционных факторов дрожжевой клетки:

• Связываясь с ДНК, фактор активирует транскрипцию гена, кодирующего белок, присутствие которого легко обнаружить

• белок-«наживка»,
• слитый с ДНК-
• связывающим
• доменом

• В дрожжевые клетки вводят два вида плазмид:

• белки, кодируемые
• клонами кДНК
• экспрессионной
• библиотеки, слитые
• с активационным
• доменом
• (один белок на клетку)

• При наличии специфического взаимодействия в колониях-клонах обнаруживается белок-репортер:

• колонии дрожжей, содержащие
• белок-репортер, изолируют для
• выделения ДНК и идентификации
• партнера

• Фаговый дисплей – еще один способ поиска
• белков-партнеров на основе библиотеки кДНК:

• кДНК из экспрессионной библиотеки встраивают
• в нитевидный фаг (M13, fd) в область гена, кодирующего также белок его оболочки

• инфекция в бактерии

• размножение фагов

• секреция фагов из клеток

• суспензия фаговых частиц, несущих на
• поверхности белки библиотеки, слитые с
• белком оболочки (фьюжн-белки)

• инкубация фагов с
• иммобилизовананным
• белком-«мишенью»

• элюция буфером,
• содержащим
• белок-«мишень»

• инфекция и
• амплификация

• повторный
• отбор

• размножение фага
• с отобранной кДНК
• в бактериях

• Гибридизация нуклеиновых кислот

• плавление при
• нагревании

• отжиг при
• охлаждении

• tº

• ДНК

• отжиг с ДНК

• отжиг с РНК

• гибридные молекулы

• Northern гибридизация РНК/ДНК: идентификация
• транскрипта и оценка уровня экспрессии гена

• молекулы мРНК разделяются электрофорезом
• и переносятся на мембрану

• мембрана затем инкубируется с ДНК-пробой, меченной
• радиоактивным фосфором или флюорохромом

Нерадиоактивные метки ДНК

• Биотин, витамин В7

• Дигоксигенин, стероид

• Карбоксифлуоресцеин

• Биотин-11-дУТФ

Поглощение: макс.	492 нм
Флуоресценция: макс.	520 нм

• флюорохромами, ферментами, антителами Чувствительность до 0,1 пг

• Сродство к (стрепт)авидину.

• Их ковалентно сшивают с

• Southern гибридизация (гибридизация по Саузерну):
• детекция специфической ДНК

• - в бактериальной колонии:

• - или в препарате ДНК:
• так же, как при Northern
• гибридизации

• мембрана

• реплика

• лизис бактерий, фиксирование и
• денатурация ДНК

• инкубация с меченой пробой

• проявление автографа

• “микрочип” с набором
• клонов кДНК,
• конкурентная
• гибридизация

• норма

• опухоль

• суммарная мРНК

• кДНК с флюоресцентной меткой

• Сравнительный анализ экспрессии генов

• анализ флюоресценции
• отдельных пятен

• смесь равных количеств двух препаратов

• tº

• плавление

• ДНК

• отжиг с комплементарным
• олигонуклеотидом

• Гибридизация ДНК с олиго-дезоксинуклеотидом

• полимеразная цепная
• реакция

• гибридизация in situ

• Реакция полимеризации ДНК

• G

• T

• A

• C

• C

• T

• A

• G

• G

• A

• C

• T

• G

• A

• C

• T

• C

• ДНК-полимераза

• двухцепочечная «затравка»

• 5’

• 3’

• 5’

• Главный компонент PCR: ДНК-полимераза

• ДНК-полимераза I из Escherichia coli – деградирует при 37º
• Taq-полимераза из Thermus aquaticus – термостабильна, работает быстро,
• но не исправляет ошибки при синтезе новой цепи (ок. 28 ошибок/106,
• скорость 1000 нуклеотидов/мин). Имеет 5’-3’-экзонуклеазную активность.
• Отсутствует 3’-5’-экзонуклеазная активность (редактирующая).
• Pfu-полимераза из Pyrococcus furiosus – термостабильна, работает
• медленнее, зато исправляет многие ошибки (имеет 3’-5’-экзонуклеазную
• активность, ок. 2-4 ошибок/106, скорость 300 нукл./мин)

• Полимеразная цепная реакция – PCR:
• амплификация специфической последовательности ДНК

• Taq-полимераза
• (изолирована из Thermus aquaticus)
• и дезоксинуклеозидтрифосфаты

• отжиг при 40-60º

• ген

• плавление при 94º

• олигонуклеотиды, комплементарные
• началу и концу гена (праймеры)
• в большом молярном избытке

• +

• матрица

• полимеризация при 72º

• +

• исходная матрица +
• 1 копия гена
• (21 копии)

• цикл 2

• цикл 3

• исходная матрица + 3 копии гена
• (22 копий)

• исходная матрица + 7 копий гена
• (23 копий)

• Применение PCR: конструирование векторной ДНК

• AgeI
• accggtatggtgagcaagggcgaggataac……

• EcoRI
• ……ccgtacctgctcgacatgttcaacttaag

• специальные праймеры:

• начало рамки

• конец рамки

• цикл 1

• цикл 2

• 28 циклов реакции

• кодирующая последовательность с тупыми концами

• кодирующая последовательность с липкими концами

• Применение PCR: введение мутаций в кодирующую
• последовательность

• PCR #1

• PCR #2

• удаление праймеров,
• денатурация и ренатурация

• P1

• P2

• PCR с праймерами P1 и P2

• достраивание 3’-концов

• г

• Применение PCR: отбор колоний
• (Colony PCR)

• бактерии из отдельных колоний

• Master Mix: нуклеотиды, Taq-полимераза, буфер, праймеры

• 23 цикла реакции

• электрофорез
• ДНК

• ?

• !

• RT – PCR: обнаружение изучаемой мРНК

• мРНК

• мРНК

• ДНК-праймер

• обратная транскриптаза

• PCR с ДНК-праймерами

• мРНК

• кДНК

• кДНК

• Клонирование ПЦР-продукта в ТА-векторе

• Real-Time PCR: TaqMan проба

• Гаврилов А.А., 2008

• Обработка результатов real-time PCR

• экспоненциальный рост флуоресценции

• Real-Time PCR: molecular beacon

• последовательность,
• присутствующая в
• PCR-продукте

• флюорохром

• гаситель
• флюоресценции

• обычный цикл PCR

• Real-Time PCR: with Sybr green I.

• Неспецифический интеркалирующий цианиновый краситель:
• поглощает синий свет(λ макс = 488 нм),
• излучает зеленый свет (λ макс = 522 нм).

• Гибридизация in situ

• интересующая
• последовательность ДНК

• + флюоресцентная или
• радиоактивная метка

• меченый ДНК-зонд

• фиксированные на стекле
• клетки с денатурированной
• ДНК и РНК (формамид, 42º)

• денатурация (75º)

• гибридизация

• метафазные хромосомы человека (мужчины)
• гибридизовали с меченной
• флюоресцеином (диоксифлюораном) пробой,
• специфичной в отношении Х-хромосомы
• (каталог “Molecular Probes”)

• Whole mount гибридизация in situ

• (Ermakova et al., 1999)

• с меченой дигоксигенином мРНК транскрипционных факторов в эмбрионах ксенопуса

• Определение последовательности ДНК

• О

• основание

• Н

• Н

• СН2

• НО

• О

• основание

• ОН

• Н

• СН2

• НО

• *

• ДНК денатурируют и по одной из ее цепей проводят
• полимеразную реакцию с нормальными и
• модифицированными нуклеозидтрифосфатами

• нормальный
• дезоксирибонуклеотид

• дидеоксирибонуклеотид-
• терминатор полимеризации ДНК

• параллельно идут четыре
• реакции, в каждой из которых
• участвуют 4 нормальных
• нуклеотида плюс небольшое
• количество какого-нибудь
• одного модифицированного

• одна из цепей ДНК отжигается
• с праймером для инициации
• полимеразной реакции

• A

• T

• G

• C

• G A C T

• чтение четырех дорожек геля снизу
• вверх дает последовательность
• нуклеотидов

• нуклеотиды-терминаторы

• продукты реакций разделяются
• по размеру электрофорезом в
• полиакриламидном геле:

Определение последовательности ДНК

• Одноцепочечную матрицу ДНК отжигают с праймером, затем
• инкубируют с ферментами ДНК-полимеразой, АТР-сульфурилазой,
• люциферазой и апиразой, а также с субстратами: аденозин-5’-
• фосфосульфатом (APS) и люциферином.

• Каждый случай включения комплементарного нуклеотида сопровождается высвобождением пирофосфата (PPi) в эквимолярном количестве.

• Пиросеквенирование. 454 Life Science

• ATP-сульфурилаза количественно преобразовывает пирофосфат в ATP в присутствии аденозин- 5’- фосфосульфата. ATP, в свою очередь, способствует превращению люциферина в оксилюциферин под действием люциферазы. При этом испускается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося ATP.

• О

• 2

• Свет обнаруживается с помощью CCD камеры, обрабатывается
• и демонстрируется как пик в пирограмме. Высота каждого пика
• пропорциональна числу включенных нуклеотидов. Невключённые
• dNTP и избыточный ATP непрерывно разрушаются апиразой.

• После того, как деградация закончена, добавляется следующий
• dNTP и начинается новый цикл пиросеквенирования.

• Подготовка образцов ДНК и прикрепление к кластерам

• Секвенирование методом синтеза на матрице. Illumina

• Фрагменты ssДНК закрепляют на твердой подложке
• ДНК полимераза синтезирует комплементарную цепь
• Встраивание каждого нового нуклеотида регистрируется
• по флюоресценции

• Секвенирование методом синтеза на матрице
• Illumina

• 1. Фрагментация dsДНК
• 2. Два адаптера пришиваются ДНК-лигазой
• 3. Амплификация полученных фрагментов ДНК (ПЦР)

• Мостиковая амплификация
• с немечеными нуклеотидами

• Образуются двунитевые
• фрагменты ДНК

Секвенирование методом синтеза

• G

• T

• C

• A

• G

• T

• C

• A

• G

• T

• C

• A

• 5’

• C

• A

• G

• T

• A

• T

• C

• A

• C

• C

• T

• A

• G

• C

• G

• T

• A

• 3’

• 5’

• C

• T

• G

• G

• флюоросигнал

• флюоросигнал

• Цикл 1:
• Добавка всех 4 нуклеотидов.
• Каждый нуклеотид помечен своим флюорозондом

• Включение первого основания

• Удаление невключенных оснований

• Детекция сигнала

• Разблокирование синтеза, ферментативное удаление метки

• Цикл 2:
• Добавка реакционной смеси и повторение
• цикла. Чтение второго нуклеотида

С матрицы считывается тип включенного в каждый кластер основания Около 1 миллиона оснований определяется за один цикл синтеза

• Последовательность ДНК определяется путем анализа всей совокупности данных, снятых с матрицы

• Секвенирование методом синтеза

Секвенирование методом синтеза на матрице

• Illumina Прикрепление единичных фрагментов
• ДНК к поверхности матрицы через Фрагментация Лигирование адаптеры
• ДНК адаптеров
• Амплификация
• ДНК

• Секвенирование

• 20 microns

• ~1000 молекул на 1 µm кластер
• ~40 000 000 кластеров на один эксперимент
• ( цит. по Разину С.В., 2012)

Секвенирование методом синтеза на матрице

• Illumina секвенировала индивидуальный геном
• африканского мужчины за несколько недель, достигнув
• скорости прочтения до 3 миллионов оснований за цикл
• (февраль 2008)

• От последовательности нуклеотидов –
• к предполагаемой последовательности аминокислот

•                                                      5‘-atgcccaagctgaatagcgtagaggggttttcatcatttgaggacgatgtataa-3'  
• 1 atg ccc aag ctg aat agc gta gag ggg ttt tca tca ttt gag gac gat gta taa    M   P   K   L   N   S   V   E   G   F   S   S   F   E   D   D   V   *   
• 2  tgc cca agc tga ata gcg tag agg ggt ttt cat cat ttg agg acg atg tat     C   P   S   *   I   A   *   R   G   F   H   H   L   R   T   M   Y   
• 3   gcc caa gct gaa tag cgt aga ggg gtt ttc atc att tga gga cga tgt ata      A   Q   A   E   *   R   R   G   V   F   I   I   *   G   R   C   I   

• Поиск открытой рамки считывания:

• В неправильных рамках часто встречаются стоп-кодоны
• (отмечены красной звездочкой)

• Конструирование кДНК клонотеки. Этап 1.

• Конструирование кДНК
• клонотеки. Этап 2.

• Hind III линкер

• палиндром линкера

• фосфорилирование 5’-
• концов

• Лигирование
• с кДНК

• Этап 3.

Схема цикла развития нитевидного фага

• кольцевая
• одноцепочечная

• 200-300 копий РФ

• (+)-цепь ДНК

• Белок рIII

• 1000х6 нм

• 6407 нукл. М13

• 6408 нукл. fd

• Белок pVIII

Сколько копий плазмиды в клетке?

• В зависимости от точки начала репликации (ori) в клетке может содержаться различное число копий плазмиды:
• - Низкокопийные (1-2 копии на клетку)
• - Высококопийные (10-100 копий на клетку)

Литература к курсу «Основы клеточной биологии»

• Патрушев Л.И. Экспрессия генов. – М.: Наука, 2000. ил. ISBN 5-02-001890-2
• Свердлов Е.Д. Взгляд на жизнь через окно генома. – М.: Наука, 2009.
• А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. Иммунология.- М.: «Мир», 2000.
• И. Сердюк, Н. Заккаи, Дж. Заккаи. Методы в молекулярной биофизике. Учебное пособие. Том I.-М.: КДУ (Книжный Дом Университет), 2009.
• ПЦР «в реальном времени». Под редакцией д.б.н. Д.В. Ребрикова.- М.:БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009.
• Оригинальные статьи.
•  

• -

• +

• Какой из двух линейных
• фрагментов ДНК имеет
• большую молекулярную массу?

• А B

• Какой из этих праймеров позволит копировать
• такую одноцепочечную ДНК?
• 5‘-ATGCCTGCAATTTCGATCGGCTATGCAGGTC-3’
• 1 2 3 4 5
• 5’-ATGCC 5’-TACGG 5’-CTGGA 5’-GACCT 5’-GGCAT

• Зачем и каким образом используют PCR в:
• диагностике?
• генетическом анализе в медицине?
• криминалистике и судебной медицине?
• палеонтологии?

Конструирование космидной клонотеки.